無菌室的要求：
1、需要建立無菌室管理制度。
2、保持良好的衛(wèi)生：相對濕度40%---60%，溫度20—22 ℃，最好安裝空調(diào)。
3、無菌室不得進(jìn)行其他工作，非操作所使用的物件一律不得放入，檢后的余樣不得存放。
4、紫外燈的使用期限一般為300小時，要記錄使用時間，到期更換。
無菌操作及要求
以菌落總數(shù)、大腸菌群為例演示無菌實驗流程
對實驗臺、手、檢驗用具進(jìn)行消毒（保證無菌環(huán)境和無菌實驗用品），微生物的理想環(huán)境是無菌，但是更應(yīng)該做好防護(hù)，保護(hù)自己。防護(hù)衣服，口罩手套必須佩帶。
對實驗的臺面進(jìn)行擦拭消毒，一般用75%乙醇或新潔爾滅溶液。
為保持無菌的進(jìn)行，對手心手腕這些容易殘留細(xì)菌的部位進(jìn)行消毒處理。
實驗臺上面的藥品、盛裝樣品的盒子等實驗用工具要進(jìn)行消毒處理。
實驗前對培養(yǎng)基的檢查、無菌條件下稱樣
1）實驗前檢查大腸菌群培養(yǎng)基的量、導(dǎo)氣管內(nèi)是否有氣泡。
2）開啟超凈臺風(fēng)機、在無菌、空氣緩慢流動狀態(tài)下工作。
3）進(jìn)行無菌稱樣，這一步其實最好是要佩帶手套的。
4）接種針滅菌
5）接菌試管口滅菌
6）取菌
在接種或向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基時，試管口或瓶壁外面不要接觸皿底，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。
總結(jié)
微生物實驗室工作人員，必須有嚴(yán)格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進(jìn)行，主要原因：
一是防止試驗操作中人為污染樣品；
二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當(dāng)造成個人污染。
要求如下：
無菌室使用與管理要求
1.工作室應(yīng)矮小、平整，面積小，高2.2-2.3米，內(nèi)部裝修應(yīng)平整、光滑，無凹凸不平或棱角等，四壁及屋頂應(yīng)用不透水之材質(zhì)，便于擦洗及殺菌。
2.室內(nèi)采光面積大，從室外應(yīng)能看到室內(nèi)情況。
3.為保證無菌室的潔凈，無菌室周圍需設(shè)緩沖走廊，走廊旁再設(shè)緩沖間，其面積可小于無菌室。
4.無菌室、緩沖走廊及緩沖間均設(shè)有日光燈及供消毒空氣用紫外燈，殺菌紫外燈離工作臺以1米為宜 ，其電源開關(guān)均應(yīng)設(shè)在室外。
5.無菌室與緩沖間進(jìn)出口應(yīng)設(shè)拉門，門與窗平齊，門縫要封緊，兩門應(yīng)錯開，以免空氣對流造成污染。
6.無菌室的使用與管理
（1） 無菌室應(yīng)保持清潔整齊，室內(nèi)僅存放必須的檢驗用具如酒精燈、酒精棉、火柴、鑷子、接種針、接種環(huán)等。不要放與檢測無關(guān)的物品
（2） 室內(nèi)檢驗用具及凳桌等保持固定位置，不隨便移動。
（3） 每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作臺、門、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液噴霧消毒空氣，最后紫外燈殺菌半小時。
（4） 定期檢查室內(nèi)空氣無菌狀況，細(xì)菌數(shù)應(yīng)控制在10個以下，發(fā)現(xiàn)不符合要求時，應(yīng)立即徹底消毒滅菌。無菌室無菌程度的測定方法：取普通肉湯瓊脂平板、改良馬丁培養(yǎng)基平板各3個（平板直徑均9厘米），置無菌室各工作位置上，開蓋曝露半小時，然后倒置進(jìn)行培養(yǎng)，測細(xì)菌總數(shù)應(yīng)置37℃溫箱培養(yǎng)48小時；測霉菌數(shù)則應(yīng)置27℃溫箱培養(yǎng)5天。細(xì)菌、霉菌總數(shù)均不得超過10個為合格 。
（5） 無菌室殺菌前，應(yīng)將所有物品置于操作之部位（待檢物例外），然后打開紫外燈殺菌30分鐘，時間一到，關(guān)閉紫外燈待用。
（6） 進(jìn)入無菌室前，必須于緩沖間更換消毒過的工作服、工作帽及工作鞋。
（7） 操作應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)定進(jìn)行，操作中少說話，不喧嘩，以保持環(huán)境的無菌狀態(tài)。
器材及場所的滅菌消毒
微生物檢驗用器材及場所必須進(jìn)行滅菌或消毒處理，不同的對象采用不同的處理方法。
1. 高壓蒸汽滅菌: 工作服、口罩、稀釋液等，置高壓殺菌鍋內(nèi)，一般采用121℃滅菌半小時,當(dāng)然不同的培養(yǎng)基有不同的要求,應(yīng)分別處理。
2. 火焰滅菌： 接種針、接種環(huán)等可直接火焰滅菌。
3. 高溫干燥滅菌： 各種玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃滅菌2小時。
4. 一 般消毒: 無菌室內(nèi)的凳、工作臺、試管架、天平、待檢物容器或包裝均無法進(jìn)行滅菌，必須用其他方法進(jìn)行消毒處理，采用2%石炭酸或來蘇兒水溶液擦拭消毒，工作人員的手也用此法進(jìn)行消毒。
5. 空氣的消毒： 開啟紫外燈照射30-60分鐘 即可。
準(zhǔn)備工作
1. 先進(jìn)行無菌室空間的消毒，開啟紫外燈30-60分鐘。
2. 檢驗用的有關(guān)器材， 搬入無菌室前必須分別進(jìn)會滅菌消毒。
3. 操作人員必須將手清洗消毒，穿戴好無菌工作衣、帽和鞋，才能進(jìn)入無菌室。
4. 進(jìn)入無菌室后再一次消毒手部，然后才進(jìn)行檢驗操作。
操作過程注意事項
1. 動作要輕，不能太快，以免攪動空氣增加污染；玻璃器皿也應(yīng)輕取輕放，以免破損污染環(huán)境。
2. 操作應(yīng)在近火焰區(qū)進(jìn)行。
3. 接種環(huán)、接種針等金屬器材使用前后均需灼燒，灼燒時先通過內(nèi)焰，使殘物烘干后再灼燒滅菌。
4. 使用吸管時，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必須用洗耳球操作。
5. 觀察平板時不好 開蓋，如欲沾取菌落檢查時，必需靠近火焰區(qū)操作，平皿蓋也不能 大開，而是上下蓋適當(dāng)開縫。
6. 進(jìn)行可疑致病菌涂片染色時，應(yīng)使用夾子夾持玻片，切勿用手 直接拿玻片，以免造成污染，用過的玻片也應(yīng)置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗滌。
7. 工作結(jié)束，收拾好工作臺上的樣品及器材，最后用消毒液擦拭工作臺。
